一、介紹

         軟骨在面部特征的形式和功能方面起著關(guān)鍵作用。當(dāng)鼻子或耳朵的軟骨因損傷而受損時，它沒有再生的能力。這意味著一旦耳朵或鼻子的軟骨結(jié)構(gòu)被破壞，耳朵或鼻子就會殘缺不全。然后，需要一個重建程序來創(chuàng)建一個具有能夠承受正常機械力的良好3D結(jié)構(gòu)的新框架。實際上，鼻竇或輕微耳缺損的重建常使用耳廓或鼻室間隔軟骨移植物進行。1，2在更廣泛的情況下，可以使用肋軟骨，為收獲提供更多的材料并提供更剛性的支撐。耳、室間隔或肋軟骨可用于重建，但移植材料的可用性通常有限，供體部位的發(fā)病率仍然是一個風(fēng)險。燒傷患者尤其如此，由于突出的位置和薄薄的皮膚覆蓋，他們經(jīng)常遭受鼻子和耳朵的廣泛損傷。1，3，4因此，再生醫(yī)學(xué)為克服這些問題提供了令人興奮的可能性。組織工程領(lǐng)域的新發(fā)展已經(jīng)進入臨床。例如，Yanaga等人進行了幾項臨床實驗，其中從耳朵分離的自體軟骨細胞中新開發(fā)的軟骨用于耳朵框架重建。2，5隨著對組織工程替代品的日益關(guān)注，我們需要有關(guān)我們正在尋求復(fù)制的組織的結(jié)構(gòu)信息。然而，文獻中關(guān)于各種面部軟骨類型（特別是耳，鼻翼和鼻間隔軟骨）之間的機械特性以及組成和結(jié)構(gòu)差異的數(shù)據(jù)很少。

    雖然它們具有共同的胚胎起源，但面部軟骨很快就會根據(jù)其特定的結(jié)構(gòu)功能分化成不同的軟骨亞型。在脊椎動物發(fā)育的早期階段，將成為頭部和頸部的胚胎區(qū)域被短暫地劃分為稱為咽弧（PA）的片段。耳朵具有組合的起源，來自PA1和PA2，它們在6周發(fā)育時形成他的小山丘。最終，這6個小山丘融合在一起形成外耳。6，7PA1進一步向外生長，形成下頜骨突和上頜骨突。后者后來形成額葉突出以及內(nèi)側(cè)和外側(cè)鼻突，其將形成鼻翼，并在最終融合到鼻中隔后形成。8

    成熟的耳軟骨由彈性蛋白纖維和膠原束的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)組成，這些膠原束被一層周旋物包圍。這種高彈性蛋白含量使其在面部區(qū)域的各種軟骨亞型中。另一方面，人類鼻子的解剖結(jié)構(gòu)由幾個獨立的結(jié)構(gòu)元素組成。主要部分是鼻中隔，為鼻梁以及鼻外側(cè)和小葉軟骨的兩側(cè)提供支撐，以支持鼻竇。該側(cè)區(qū)域還包括幾個芝麻軟骨和附屬軟骨。與耳軟骨相比，鼻部結(jié)構(gòu)全部由透明軟骨組成。透明軟骨主要由膠原蛋白組成，特別是II型，分為幾個區(qū)域。9

    細胞外基質(zhì)（ECM）結(jié)構(gòu)及其生化組成對軟骨的機械功能至關(guān)重要。標準生化測定可用于測定主要組織組分的濃度。為了可視化ECM的3D結(jié)構(gòu)，多光子激光掃描顯微鏡已被用于其他組織，如關(guān)節(jié)軟骨。10該方法能夠揭示必需的基質(zhì)成分，即軟骨細胞，膠原蛋白和彈性蛋白纖維，無標記，具有亞細胞分辨率和深度滲透。11

    據(jù)報道，面部軟骨類型的僵硬差異很大。由于使用不同的技術(shù)來測量軟骨，因此很難給出一般值。除了具有不同局限性和優(yōu)點的拉伸或壓痕測量外，12辨別機械測試的不同幅度或規(guī)模也很重要。對于大機械性狀的評估，對于維持大形狀很重要，特別是在手術(shù)重建中，已經(jīng)描述了各種技術(shù)。13–16這同樣適用于原子力顯微鏡（AFM），其中對軟骨的表面微觀力學(xué)進行了廣泛的研究。17–19然而，在AFM和粗大機械測試之間，支架細胞環(huán)境的機械條件對細胞的行為有重要影響。20因此，它是軟骨充分再生的基礎(chǔ)。21因此，需要深入了解ECM水平上的局部機械性能和結(jié)構(gòu)，以便為細胞分化提供合適的環(huán)境。本研究中使用的設(shè)備允許在更高深度范圍內(nèi)以微米級壓痕，提供有關(guān)不同軟骨亞型的基本機械信息。

     了解組織結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)知識對于充分的組織工程至關(guān)重要。從實踐中，外科醫(yī)生熟悉了重建手術(shù)中軟骨的粗機械特征。然而，機械行為基本上是通過細胞及其周圍結(jié)構(gòu)的復(fù)雜共生在微觀尺度上確定的。

     在本文中，我們的目標是通過使用新技術(shù)在ECM水平上評估這些參數(shù)，在結(jié)構(gòu)和機械水平上提供有關(guān)面部軟骨類型之間差異的基本信息。雖然沒有直接的實際意義，但它也可以為外科醫(yī)生提供新的見解和靈感，通過更好地了解他們所處理的組織的性質(zhì)來優(yōu)化他們的重建工作。隨著再生醫(yī)學(xué)的進步，外科醫(yī)生將達到一個點，這些知識將被證明是無價的。

二、方法

    （1）樣品

     根據(jù)該機構(gòu)的道德準則，從10名新鮮冷凍尸體供體（8名男性，2名女性）中收集軟骨樣本，平均年齡為66.5±6年。從每個供體中，用4mm活檢打孔器從耳殼，內(nèi)側(cè)鼻絲軟骨和外側(cè)鼻翼軟骨中取出2個相鄰樣本。樣品在-20°C下運往VU大學(xué)（荷蘭阿姆斯特丹）進行生物力學(xué)和微觀評估，或EMC（荷蘭鹿特丹）進行生化評估。在實驗前解凍樣品，并通過手術(shù)切除剩余的組織和周邊。

    （2）凹痕

         為了確定機械性能，使用新型商用納米壓痕儀（Piuma;Optics11，荷蘭阿姆斯特丹）。該設(shè)備采用套圈頂懸臂探頭22施加負載并使用基于光纖的讀數(shù)同時測量壓痕深度（圖1.（圖1A，1A， C）。在此設(shè)置中，使用了直徑為78 μm的球形探頭，能夠在壓痕深度為1至17 μm時施加0.1 μN至7.5 mN的力。在每個系列實驗之前，通過縮進剛性表面并將懸臂彎曲等同于探頭位移來執(zhí)行懸臂彎曲校準。每個樣品在同一解剖位置上以網(wǎng)格模式縮進10次，測量之間的距離為100μm。由此產(chǎn)生的應(yīng)力應(yīng)變曲線（圖.（圖1B）1B）使用Oliver和Pharr推導(dǎo)的球形壓頭的數(shù)學(xué)模型進行分析，以確定有效的楊氏模量（E *）。23壓痕協(xié)議經(jīng)過精心優(yōu)化，以最大限度地減少影響測量的粘彈性效應(yīng)（未顯示數(shù)據(jù)）。

圖 1.

壓痕和多光子激光顯微鏡技術(shù)概述。A，懸臂壓痕裝置的設(shè)置（Piuma，Optics11）。B、軟骨測量的壓痕曲線示例。紅色切線表示用于確定楊氏效應(yīng)模量的卸載曲線的斜率。C，壓頭的圖形細節(jié)，球形成壓頭的（φ78μm）。D，光學(xué)設(shè)置多光子激光掃描顯微鏡TriMScope I（LaVision Biotech），鈦藍寶石激光器。E，SHG通道顯示膠原蛋白束。F，2PF通道顯示彈性蛋白纖維。BP，帶通濾波器;CIT，懸臂壓痕;DM，二向色鏡;GS， X-Y 振鏡掃描鏡;紅外-L， 紅外激光;紅外-PD，紅外激光二極管;L，透鏡在PMT的前部;MO，顯微鏡物鏡;OF， 光纖;聚酰胺，光電倍增管;SL，掃描鏡頭;TL，鏡筒透鏡。

   （3）生化評價

        在生化分析之前，測定所有軟骨樣品的濕重，然后在60°C下在木瓜蛋白酶溶液（0.2M Na）中消化過夜2H2采購訂單4， 0.01M 乙二胺四乙酸乙酯2O，250μg/ mL木瓜蛋白酶，5mM L-半胱氨酸，pH 6.0）。

    每個木瓜蛋白酶消化的軟骨樣本中測量的DNA量由溴化乙錠（GibcoBR1）測定，使用小牛胸腺DNA（Sigma-Aldrich）作為標準。用分光熒光計（Wallac 1420 Victor 2;Perkin-Elmer，韋爾斯利，馬薩諸塞州），使用消光濾光片（340 nm）和發(fā)射濾光片（590 nm）。

    進行1，9-二甲基亞甲基藍（DMMB;pH 3.0）測定以測量每個木瓜蛋白酶消化軟骨樣品中的硫酸糖胺聚糖（GAG）含量。使用VersaMax分光光度計在530和590nm處監(jiān)測DMMB的異色反應(yīng)。以鯊魚硫酸軟骨素C為標準。根據(jù)制造商的說明，使用總膠原蛋白測定法（荷蘭萊頓的QuickZyme Biosciences）測量羥脯氨酸含量以估計膠原蛋白數(shù)量。簡而言之，將木瓜蛋白酶消化物在95°C下用等體積的12M HCl水解18-20小時。使用Prockop和Udenfriend方法（Prockop和Udenfriend，1960）的修飾測量羥脯氨酸含量，并歸一化為樣品濕質(zhì)量。

     根據(jù)制造商的說明，使用Fastin彈性蛋白測定（Biocolor，Carrickfergus，UK）測量軟骨樣品的彈性蛋白含量。簡而言之，軟骨樣品在加入試劑盒的染料之前，在100°C下在0.25M草酸中通過3個過夜熱提取循環(huán)轉(zhuǎn)化為水溶性α彈性蛋白。在VersaMax板讀數(shù)器上在513nm處測量吸收。來自牛頸韌帶的α彈性蛋白（由制造商提供）被用作標準。

    （4）多光子顯微鏡

     軟骨的結(jié)構(gòu)信息是通過多光子激光掃描顯微鏡獲得的，使用來自未處理的軟骨的固有光信號。成像設(shè)置包括商用2光子激光掃描顯微鏡（2PLSM，TriMScope I;Lavision BioTec GmbH）和飛秒激光源（圖2（圖1D）。1激光源為飛秒Ti藍寶石激光器（相干變色龍Ultra II），在800 nm處產(chǎn)生約200 fs脈沖，線性偏振，重復(fù)頻率為80 MHz。激光束通過25×1.N.A.水浸物鏡（尼康A(chǔ)PO LWD）聚焦在軟骨樣品上，橫向分辨率約為0.5μm，軸向分辨率為約2μm。將樣品上的激光功率調(diào)節(jié)在5-50 mW范圍內(nèi)，以獲得足夠的信噪比并避免組織光損傷。激光束通過一對振鏡橫向掃描在樣品上。深度掃描是通過用步進電機移動物鏡來完成的。

     二次諧波（SHG）和2光子熒光（2PF）光子由膠原（SHG，2PF）和彈性蛋白（2PF）纖維以及細胞內(nèi)自發(fā)熒光蛋白產(chǎn)生，并在表觀幾何中收集。SHG和2PF光子通過二向色鏡（色度T695lpxrxt）從800nm激發(fā)光子中過濾，然后通過二向色鏡（色度425lp）分成SHG和2PF通道，通過SHG（色度Z400 / 10X）和2PF（色度HQ500 / 140M-2P）的干涉濾光片，并通過高靈敏度GaAsP光電倍增管（Hamamatsu H7422-40）檢測（圖。（圖1E，1E， F）。

     使用TriMScope I軟件（“Imspector Pro”）進行數(shù)據(jù)采集，并以16位tiff格式存儲圖像堆棧，并使用“ImageJ”軟件（MacBioPhotonics）進一步處理和分析。

     （5）統(tǒng)計分析

     使用具有Bonferroni校正的混合模型分析生化差異。組間有效楊氏模量的差異是通過廣義估計方程確定的。為了測量剛度與生化含量之間的相關(guān)性，使用了二元相關(guān)性模型。所有分析均使用SPSS統(tǒng)計軟件版本22進行。P值小于0.05被認為是顯著的。

三、結(jié)果

（1）凹痕

    壓痕顯示耳軟骨（1.14±0.71 MPa）和鼻間隔軟骨（2.65±1.78 MPa）和鼻竇軟骨（1.26±0.51 MPa）和鼻間隔軟骨（P = 0.005）之間的硬度差異（P = 0.011）（圖。（圖 2）。2).然而，阿拉鼻與耳軟骨的比較顯示沒有顯著差異。每個軟骨類型的硬度在供體之間差異很大（參見圖，補充數(shù)字內(nèi)容1，其中顯示每個軟骨類型的供體之間的硬度差異很大。

圖 2.

壓痕顯示耳軟骨和鼻間隔軟骨之間的硬度差異顯著（*P = 0.011）以及鼻竇軟骨和鼻間隔軟骨之間的硬度差異（**P = 0.005）。鼻疙瘩和耳軟骨之間未見顯著差異。

    （2）生物化學(xué)

     鼻軟骨（2.35±1.20 μg/mg干重）中基于DNA含量的細胞密度顯著高于耳朵軟骨（1.13±0.23 μg/mg干重）或鼻中隔（0.94±0.52 μg/mg干重）（P = 0.005和P = 0.001）（圖。（圖 3A）。3耳軟骨（141.40±27.2μg/mg干重）的彈性蛋白含量明顯高于鼻竇蛋白（60.12±18.35μg/mg干重）和隔膜（17.38±16.71μg/mg干重）（圖.（圖 3B）。3B）.軟骨類型間水和膠原蛋白含量無顯著差異（圖.（圖3C）。3在鼻子中，鼻中隔（96.00±23.21μg/mg干重）的GAG含量似乎略高于鼻腔（64.61±30.42μg/mg干重）（圖。（圖3）3D).

圖 3.

生化分析結(jié)果顯示軟骨類型之間的組成存在明顯差異。雖然鼻腔軟骨和鼻中隔在組織結(jié)構(gòu)上具有很強的相似性，但它們在DNA和GAG含量方面存在顯著差異（P分別為0.001和P = 0.024）。鼻軟骨含有非常有限的彈性蛋白。這可能部分歸因于結(jié)締組織殘留物，盡管已謹慎地盡可能多地去除這些結(jié)締組織殘留物。

根據(jù)軟骨亞型，有效的楊氏模量與細胞密度，GAG或膠原蛋白含量沒有顯著相關(guān)性。然而，在室間隔軟骨中，彈性蛋白含量低與硬度較高有關(guān)（表（表11).

表 1.

二元相關(guān)性模型，顯示每個軟骨亞型的生化組成與剛度（有效楊氏模量）之間的相關(guān)性

   （3）多光子顯微鏡

     在矢狀面的中段對2個供體的軟骨樣本進行成像。生成的SHG和2PF顯微鏡顯示耳軟骨和鼻源軟骨之間存在顯著差異（圖。（圖 4）。4).不僅彈性蛋白纖維（綠色）的缺失明顯，鼻軟骨的一般結(jié)構(gòu)也與耳朵不同。與耳軟骨的致密纖維網(wǎng)絡(luò)相比，來自鼻腔區(qū)域的軟骨提供更彌漫的圖像。軟骨是軟骨細胞在其細胞周圍基質(zhì)內(nèi)的團聚物，在兩個供體中都比鼻竇中隔大。

圖 4.

從上到下：供體樣本3和5。從左到右：阿拉納西，隔膜，耳朵。綠色：彈性蛋白;紅色：膠原蛋白。與鼻軟骨樣本中的彌漫性綠色背景信號相比，耳軟骨中的纖維結(jié)構(gòu)清晰可辨。如圖所示圖 3，3，DNA含量變化很大，這在隔膜圖像的不同細胞密度中也可以辨別出來。

四、討論

  據(jù)我們所知，這是第一項比較人類供體中所有3種面部軟骨類型之間的生化，3D結(jié)構(gòu)和機械差異的研究。通過在ECM水平上測量軟骨組成，結(jié)構(gòu)和剛度的差異，我們旨在確定足夠的組織工程所必需的面部軟骨結(jié)構(gòu)的重要方面。

    這與軟骨的組織工程有關(guān)，軟骨在過去十年中受到了廣泛的關(guān)注。已經(jīng)提出了各種不同的細胞類型和支架，用于耳骨或鼻軟骨工程。24–29雖然已經(jīng)獲得了有希望的結(jié)果，但大多數(shù)再生組織通常只是原始組織的非常邊緣的替換。這項研究表明，在ECM尺度上，軟骨類型之間存在顯著差異，即使它們在機械性能上相似。

    已知耳軟骨的組成與鼻間隔軟骨不同，因為它含有彈性纖維。29我們可以通過生化分析測量鼻軟骨中少量的彈性蛋白。這與新西蘭白兔的一項研究一致，該研究使用免疫組織化學(xué)染色，在耳軟骨基質(zhì)中特異性地發(fā)現(xiàn)了高彈性蛋白含量，而在鼻間隔細胞周圍區(qū)域僅發(fā)現(xiàn)了中等彈性蛋白含量。30基質(zhì)包含相當(dāng)一部分彈性蛋白的事實表明，這可能為耳軟骨的機械質(zhì)量提供重要的歸因。3

    耳窩軟骨和鼻腔軟骨的有效楊氏模量顯著低于鼻中隔軟骨。然而，耳朵和鼻軟骨之間的僵硬在統(tǒng)計學(xué)上沒有差異，盡管彈性蛋白含量有明顯差異。這些發(fā)現(xiàn)與Griffin等人的觀察結(jié)果相符。32誰發(fā)現(xiàn)鼻竇和鼻間隔軟骨之間的硬度差異相似。

     在最近的一篇文章中，Nimeskern等人。33探索彈性蛋白如何影響軟骨的機械行為。他們發(fā)現(xiàn)牛透明關(guān)節(jié)軟骨和耳軟骨的粘彈性行為不同，耳軟骨更具彈性，而關(guān)節(jié)軟骨對瞬時負荷表現(xiàn)出更高的抵抗力。在酶處理以去除彈性蛋白和/或GAG時，他們證明耳軟骨的壓縮機械性能似乎主要是由于彈性蛋白纖維網(wǎng)絡(luò)，而這些性能是由關(guān)節(jié)軟骨中的膠原蛋白提供的。此外，GAG對軟骨類型之間機械行為的影響似乎不同：在耳軟骨中，GAG對力學(xué)沒有重大影響，而在關(guān)節(jié)軟骨中，GAG具有明顯的影響。雖然組織不同，但在真皮瘢痕組織中也注意到彈性蛋白的預(yù)期作用與實際機械性能之間的這種明顯差異。34這證明了組織組成在組織的機械功能中的復(fù)雜作用。

     軟骨類型之間機械行為的差異不僅可以通過其生化成分確定，還可以通過組織結(jié)構(gòu)來確定。使用多光子激光掃描顯微鏡，可以詳細描繪不同軟骨類型的3D結(jié)構(gòu)。有趣的是，盡管鼻竇腸炎在外觀上與鼻間隔軟骨非常相似，彈性蛋白含量也很低，但其機械行為與耳軟骨更相似。（參見視頻，補充數(shù)字內(nèi)容2，它在3D堆疊圖像視頻中顯示ala nasi軟骨結(jié)構(gòu)的多光子激光掃描顯微鏡， 并查看視頻，補充數(shù)字內(nèi)容3，它在3D堆疊圖像視頻中顯示隔膜軟骨結(jié)構(gòu)的多光子激光掃描

     雖然在一般外觀上相似，但我們觀察到軟骨大小似乎在鼻中隔軟骨和隔膜軟骨之間有所不同。然而，樣本量很小，沒有收集到任何統(tǒng)計證據(jù)來支持這一方面的發(fā)現(xiàn)。

     供體變異性很大，并且很難將我們的數(shù)據(jù)與文獻進行一般比較，因為以前沒有進行過在機械，結(jié)構(gòu)和生化方面比較這3種軟骨類型的研究。我們的數(shù)據(jù)與Nimeskern等人的觀察結(jié)果相符。29隔膜軟骨比耳軟骨更硬，含有更高的GAG，但DNA較低，表明細胞濃度較低。我們的發(fā)現(xiàn)也與Griffin等人進行的一項研究的結(jié)果相匹配。32與鼻中隔相比，測量鼻竇軟骨硬度較低的人。對于組織工程目的，進行壓痕實驗的尺度為細胞水平上適當(dāng)?shù)闹Ъ軇偠忍峁┝撕芎玫膮⒖肌HG被證明是在3D中無創(chuàng)地描繪膠原蛋白和彈性蛋白束結(jié)構(gòu)的好工具（參見視頻，補充數(shù)字內(nèi)容4，它在3D堆疊圖像視頻中顯示耳朵軟骨結(jié)構(gòu)的多光子激光掃描顯微鏡。這些信息可以轉(zhuǎn)化為3D打印支架的結(jié)構(gòu)模板，并與力學(xué)和生化內(nèi)容數(shù)據(jù)一起為面部軟骨重建的支架優(yōu)化提供了新的一步。

     我們使用高齡捐贈者的軟骨樣本（平均66.5±6歲）。年輕患者的機械行為和組織學(xué)可能因衰老過程中的鈣化和結(jié)構(gòu)變化而有所不同。例如，耳朵在一生中體積持續(xù)擴大，這歸因于衰老過程中彈性纖維的變化。35然而，對于隔膜，Richmon等人。16發(fā)現(xiàn)年齡和性別之間的機械性能沒有顯著差異。雖然樣本來自所有供體的同一解剖位置，但可能發(fā)生了微小的變化。這是一個限制，因為一些研究表明，在單獨的軟骨類型中，含量存在區(qū)域差異。32盡管面部軟骨的定位和作為軟組織支持的可比作用表明相似的特征，但面部軟骨實際上與另一個軟骨*不同。軟骨組織的特定功能，例如，關(guān)節(jié)軟骨的壓迫和耳軟骨的柔韌性，可能需要不同的機械測試方案。我們選擇微壓痕來探索ECM的剛度;關(guān)于我們的發(fā)現(xiàn)，也許有必要結(jié)合機械測試才能引發(fā)各種軟骨成分的不同結(jié)構(gòu)作用。在未來，包括宏觀力學(xué)測試可能會很有趣，因為大機械性狀也受到其他因素的影響，如圍鋌和解剖學(xué)形式。15，36

     從外科手術(shù)的角度來看，有趣的是，組織組成和機械行為并不總是像預(yù)期的那樣相關(guān)。我們沒有找到阿拉鼻軟骨硬度較低的解釋。它確實支持這樣一種概念，即來自不同來源的組織移植可以作為重建手術(shù)中的結(jié)構(gòu)替代物。使用貝殼組織進行阿拉鼻重建就是一個很好的例子。本文未涉及但需要考慮的其他領(lǐng)域是細胞相互作用，包括蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝，因為細胞存活和行為是組織工程和長期成功移植的關(guān)鍵。面部軟骨類型不僅在結(jié)構(gòu)上不同，而且在細胞含量上也有所不同，這一發(fā)現(xiàn)可能對手術(shù)重建有影響，因為具有較高細胞濃度的組織在移植時可能需要更豐富的營養(yǎng)環(huán)境。在我們看來，實踐經(jīng)驗和基礎(chǔ)研究知識的融合將證明在一個組織工程迅速成為現(xiàn)實的世界中至關(guān)重要，這是外科醫(yī)生不容忽視的發(fā)展。

    了解組織的完整組成，結(jié)構(gòu)，機械和生化，對于再生適當(dāng)?shù)闹Ъ墉h(huán)境以進行面部軟骨再生至關(guān)重要。這尤其反映在一個發(fā)現(xiàn)中，盡管其3D結(jié)構(gòu)與鼻中隔軟骨相似，但鼻竇具有與耳軟骨更相似的基質(zhì)硬度。有鑒于此，彈性蛋白的作用仍有待進一步引出，也許我們應(yīng)該質(zhì)疑它的名字在它對組織力學(xué)的貢獻方面是否沒有誤導(dǎo)性。